摘 要
目的：建立可靠的体内分析方法学，并进行体内动物实验探索纳米制剂USP、UCP在体内的药代动力学特征。方法：以高效液相色谱法测定体内紫杉醇浓度并对建立的体内方法学进行验证，再将SD大鼠分组，分别给予纳米制剂USP、UCP和紫杉醇注射剂，一定时间后取样并处理，再进行血药浓度的测定和药代动力学参数的确定。结果：体内分析方法学的精密度的RSD值均小于3.33%，准确度试验结果显示低、中、高三种浓度的准确度在98.86%-101.74%之间，RSD值均小于3.19%，提取回收率的结果显示低、中、高三种浓度的提取回收率值均在92.66%-94.85%之间，RSD值均小于4.38%，专属性实验结果良好。体内动物实验显示USP、UCP纳米制剂具有相似的药动学行为，相比于Taxol口服组，其半衰期由11.68 h分别延长至20.46 h和18.08 h，Cmax值分别提高了5.67倍和5.42倍，且生物利用度分别提高了6.90倍和5.27倍。结论：该方法专属性高、灵敏、稳定性好，可用于SD大鼠血浆中紫杉醇的含量测定。SD大鼠体内药代动力学研究结果表明，前药纳米制剂USP、UCP口服的生物利用度和药代动力学参数对比传统紫杉醇注射剂均有所提高。
关键词：紫杉醇；熊去氧胆酸；纳米制剂；药代动力学研究
Oral Pharmacokinetic Study of Ursodeoxycholic Acid-Paclitaxel Prodrug Nanoparticles
ABSTRACT
Objective: To establish a reliable in-vivo analytical methodology and conduct in-vivo animal experiments to explore the pharmacokinetic characteristics of the nano-formulations USP and UCP in vivo.
Method: The concentration of paclitaxel in vivo was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC), and the established in-vivo methodology was verified. Then, SD rats were divided into groups and were respectively given the nano-formulations USP, UCP and paclitaxel injection. After a certain period of time, samples were collected and processed, and then the determination of the blood drug concentration and the determination of pharmacokinetic parameters were carried out.
Results: The relative standard deviation (RSD) values of the precision of the in-vivo analytical methodology were all less than 3.33%.The accuracy test results showed that the accuracy of low, medium, and high concentrations ranged from 98.86% to 101.74%, and the RSD values were all less than 3.19%. The results of the extraction recovery rate showed that the extraction recovery rates of low, medium and high concentrations were all between 92.66% and 94.85%, and the RSD values were all less than 4.38%. The results of the specificity experiment were good. The in-vivo animal experiments showed that the USP and UCP nano-formulations had similar pharmacokinetic behaviors. Compared with the Taxol oral group, their half-lives were extended from 11.68 h to 20.46 h and 18.08 h respectively, the Cmax values were increased by 5.67 times and 5.42 times respectively, and the bioavailability was increased by 6.90 times and 5.27 times respectively.
Conclusion: This method has high specificity, sensitivity and good stability, and can be used for the determination of the content of paclitaxel in the plasma of SD rats. The results of the pharmacokinetic study in SD rats show that the bioavailability and pharmacokinetic parameters of the prodrug nano-formulations USP and UCP administered orally are all improved compared with those of the traditional paclitaxel injection.
Key words: Paclitaxel, Ursodeoxycholic acid, Nanopharmaceutics, Pharmacokinetic study
紫杉醇纳属于生物药剂学分类系统（BCS）中的BCS IV[1]药物，其水溶性和渗透性极差。而纳米制剂与传统制剂相比具有改善药物水溶性和稳定性、延长药物循环时间以及降低毒副反应等优点[2]。目前已有不少研究者致力于紫杉醇纳米制剂药代动力学研究，如陆少劲等[3]，已经证明了紫杉醇纳米制剂的在体内的生物利用度等较紫杉醇注射剂有所提高。基于以上研究背景，本课题想通过药代动力学研究探讨该前药纳米粒USP、UCP在体内的药代动力学特点。
本次实验进行的是紫杉醇体内药代动力学研究，分析的样品为生物样品，因此必须要建立灵敏，专一，精确，可靠的生物样品分析方法[4]。建立适宜的紫杉醇生物样品分析方法对紫杉醇的药代动力学研究具有重要的意义。据报道，已有多种测定紫杉醇生物样品的分析方法，主要有高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV），酶联免疫检测法，荧光免疫检测法，高效液相色谱串联质谱检测法等[5]，因为高效液相色谱法具有灵敏度高，操作简便等优点，本实验选用该方法测定。除此以外，对紫杉醇的体内研究，还需要进行专属性实验[6]，精密度实验[7]，回收率试验[8]和稳定性考察[9]等。例如黄绍秋[10]等在建立紫杉醇体内分析方法学时做了以上研究。因此，本实验以此为依据建立方法学，进行体内紫杉醇浓度的测定。总而言之紫杉醇体内分析方法学的建立有利于提高实验数据的准确性和可靠性，在紫杉醇生物样品分析中十分重要。
药代动力学参数[11]是定量描述药物在体内吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程的关键指标，在对紫杉醇进行药代动力学研究时，以下几点常常是人们研究的重点：如达峰时间(Tmax)，峰浓度(Cmax)，生物利用度(F)，消除半衰期（t1/2）和药时曲线下面积(AUC)。
特别是生物利用度，往往是判断紫杉醇纳米制剂在体内性质优劣的关键。本次实验也将研究以上药代动力学参数，用来探讨前药纳米粒USP、UCP在体内性质的优劣。
本课题旨在研究纳米制剂USP、UCP口服在雌性SD大鼠体内的药代动力学，获得药代动力学参数，并将其与传统的紫杉醇注射剂在雌性SD大鼠中的药代动力学参数作比较，判断其生物利用度是否有所提高，而为其后期实验提供理论依据。
本课题的研究内容，首先对紫杉醇体内分析方法进行建立并证实该方法的可行性，之后对比了紫杉醇注射剂与两种纳米制剂的口服药代动力学差异。
生产厂家 | |
紫杉醇注射液 | 海南中化联合制药工业股份有限公司 |
纳米制剂USP | 实验室制 |
纳米制剂UCP | 实验室制 |
紫杉醇 批号：JZ23050211 | 南京景竹生物科技有限公司 |
多西他赛 批号：K1820061 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
磷酸 | 潍坊市晨阳化工有限公司 |
二硫苏糖醇 批号：H1711046 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
肝素钠 | 常州千红生化制药股份有限公司 |
色谱乙腈 | 西陇科学股份有限公司 |
表2.2 仪器表
生产厂家 | |
电子天平 型号：BSA224S | 德国Satorius |
HT300R高速冷冻离心机 | 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 |
HGC-12A氮吹仪 | 上海标隆仪器有限公司 |
LC-20AT 高效液相色谱仪 | 日本岛津公司 |
Vortex Genius 3自动涡旋仪 | 艾卡仪器设备有限公司 |
TDZ5-BP离心机 | 张家港市鑫栎晨离心机械有限公司 |
表2.3 实验动物表
厂家/许可证号 | |
实验动物（SPF级） | 雌性SD大鼠20只，体重200±20g |
实验动物厂家 | 河南斯克贝斯生物科技股份有限公司 |
实验动物质量合格证号 | No. 410981230100031334 |
实验动物许可证 | SCXK（豫）2019-0002 |
动物饲料生产许可证号 | 豫饲证（2008）25540 |
注：所有动物实验均经过河南大学动物实验伦理委员会批准同意（许可证号：HUSOM-2024-372）。 | |
精密称取10 mg PTX用色谱乙腈溶解完全后转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度线处，摇匀，即得100 μg/mL的PTX对照品母液。精密量取适量对照品母液用乙腈配置成浓度80 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的标准溶液。
精密称取5 mg多西他赛（DTX）用色谱乙腈溶解完全后转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度线处，摇匀得100 μg/mL的DTX母液。精密移取20 mL DTX母液置于100 mL容量瓶中，用乙腈定容得20 μg/mL的DTX溶液作为内标溶液。
总PTX测定样品处理方法：取血浆100 μL，加100 μL内标溶液，以及100 μL含1 mM 二硫苏糖醇（DTT）的乙腈溶液（USP组）或100 μL 2%甲酸溶液（UCP组），涡旋5 min后，加入300 μL乙腈，置于恒温振荡箱孵育2 h后10000 r/min离心5 min，取上清液，45 ℃氮气吹干，200 μL乙腈复溶，涡旋90 s，10000 r/min离心3 min，取上清液20 μL进样。
游离PTX测定样品处理方法：取血浆100 μL，再加100 μL内标溶液，加300 μL的乙腈，涡旋3 min，之后10000 r/min离心5 min，取上清液，45 ℃氮气吹干，200 μL乙腈复溶，涡旋90 s，10000 r/min离心3 min，取上清液20 μL进样。
色谱柱：COSMOSIL C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.3%磷酸：乙腈=40：60；流速1.0 mL/min；检测波长：227 nm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL。
取大鼠空白血浆、大鼠空白血浆加标准品溶液、大鼠空白血浆加内标品溶液、大鼠空白血浆加标准品及内标品溶液，分别按上述3.2项下方法处理后，经高效液相色谱仪进样并记录谱图，以此来考察样品的专属性。
取大鼠空白血浆100 μL，分别加入50 μL PTX标准溶液和50 μL DTX内标溶液。按上述样品处理方法，使相应血浆药物浓度分别为0.02、0.1、0.2、1、2、10、20 μg/mL，按上述色谱条件进样，记录紫杉醇与内标药物多西他赛的峰面积，以两者峰面积比值为纵坐标，以紫杉醇浓度为横坐标，建立线性回归方程。
取大鼠空白血浆100 μL，配制高、中、低的混合标准溶液，即最终血浆中PTX的浓度为0.1、1、10 μg/mL，每个样品平行6份。分别在日内及日间对其重复测定，考察样品精密度，然后记录所测得的色谱峰面积，代入所得线性方程中计算得日内和日间精密度的RSD值。
取大鼠空白血浆100 μL，按上述样品处理方法处理血样，使得最终血浆中PTX的浓度为0.1、1、10 μg/mL，每个样品平行3份。HPLC进样测定PTX以及DTX峰面积，代入线性回归方程中求得PTX实测浓度，考察血浆样品中PTX的方法回收率。
配制高、中、低三种浓度的PTX血浆样品，按上述样品处理方法处理血样后进样，记录样品峰面积并求得PTX浓度。同时配制高、中、低三种浓度的PTX乙腈标准液，经0.22 μm滤膜过滤后按照同样的HPLC检测方法，记录出峰面积并求得样品浓度。两者对比计算得到经血浆处理后的PTX的准确度
取空白大鼠血浆100 µL，按上述样品处理方法处理血样制备低、中、高三个浓度（0.1、1、10 μg/mL）的血浆样品，每个浓度平行三份，考察样品在不同条件下的稳定性：（1）血浆样品室温下放置4 h进行血浆样品处理分析；（2）预处理后的血浆样品室温下放置12 h进行血浆样品处理分析；（3）血浆样品经过三次冻融循环进行血浆样品处理分析；
SD大鼠随机分为4组，每组5只，提前禁食过夜排除食物对吸收的影响。分别给予紫杉醇注射液静注（Taxol，i.v.），口服灌胃紫杉醇注射液（Taxol，p.o.）、纳米制剂USP（p.o.）和UCP（p.o.），PTX的剂量均为10 mg/kg。给药结束后在0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h采集血样至肝素化试管中。血样以8000 rpm离心5 min后得血浆样品，并在-80 ℃下储存直至分析。
所有实验均至少重复三次，实验数据均以平均值±标准差表示，使用DAS 2.0和GraphPad 8.0软件进行数据分析。
如图4.1所示，为空白血浆、空白血浆分别加标准品与内标品，以及空白血浆同时加标准品及内标品的高效液相色谱图。可见空白血浆中的内源性物质对于PTX无干扰。同时PTX和DTX的保留时间分别为17.1 min（a）和14.3 min（b），两者分离较好，互不影响，故该方法具有较好的专属性。
图4.1 (a)空白血浆、(b)空白血浆加标准品、(c)空白血浆加内标品、(d)空白血浆加标准品与内标品的HPLC色谱图
按上述血浆样品处理方法得到不同浓度的PTX待测溶液，以PTX/DTX峰面积为纵坐标，以PTX的浓度为横坐标，建立线性回归方程，得到图4.2所示的PTX线性回归方程，Y=0.3957X+0.0652，R2=0.9995，表明在0.02-20 μg/mL的浓度范围内，药物峰面积与浓度具有良好的线性关系。
图4.2 PTX线性回归方程
表4.1为精密度考察结果，设置低、中、高三种浓度进行实验，三种浓度的日内及日间精密度的RSD值均小于3.33%，说明该方法精密度良好，符合要求。
— | 日内 | 日间 | ||
C(μg/mL) | Mean±SD(μg/mL) | RSD(%) | Mean±SD(μg/mL) | RSD(%) |
0.10 | 0.10±0.01 | 2.69 | 0.10±0.01 | 2.97 |
1.00 | 1.10±0.02 | 2.08 | 1.04±0.03 | 3.33 |
10.00 | 10.09±0.17 | 1.70 | 9.94±0.31 | 3.14 |
表4.2为准确度试验结果，低、中、高三种浓度的准确度试验在98.86%-101.74%之间，RSD值均小于3.19%，表明准确度试验结果良好，符合要求。
C(μg/mL) | Results(μg/mL) | Mean Results(μg/mL) | Mean Recovery(%) | RSD(%) |
0.10 | 0.10 | 0.10 | 101.70 | 3.00 |
0.11 | ||||
0.10 | ||||
1.00 | 0.98 | 1.02 | 101.74 | 3.19 |
1.02 | ||||
1.05 | ||||
10.00 | 10.01 | 9.86 | 98.86 | 2.01 |
9.64 | ||||
9.94 |
提取回收率结果如表4.3所示，低中高三种浓度的提取回收率值均在92.66%-94.85%之间，RSD值均小于4.38%，其结果符合方法学要求。
C(μg/mL) | Recovery(%) | Mean(%) | RSD(%) |
0.10 | 95.70 | 92.66 | 4.38 |
94.22 | |||
88.05 | |||
1.00 | 93.69 | 94.20 | 3.41 |
97.63 | |||
91.26 | |||
10.00 | 97.96 | 94.85 | 3.45 |
95.15 | |||
91.44 |
表4.4、4.5、4.6所示分别为血浆样品室温下放置4 h后处理样品结果、血浆样品处理后放置12 h测定以及血样经过三个冻融循环后处理血样进行测定的结果。分别设置三个浓度，其RSD值均小于4.36%，表明该方法稳定性良好，符合生物样本方法学要求。
C(μg/mL) | Mean±SD(μg/mL) | RSD(%) |
0.10 | 0.11±0.01 | 3.39 |
1.00 | 1.02±0.03 | 3.20 |
10.00 | 10.16±0.22 | 2.21 |
表4.5 血样处理后放置12 h（n=3）
C(μg/mL) | 0 h | 2 h | 4 h | 6 h | 8 h | 10 h | 12 h | Mean | RSD(%) |
0.100 | 0.099 | 0.101 | 0.097 | 0.105 | 0.098 | 0.095 | 0.095 | 0.099 | 3.442 |
1.000 | 1.004 | 0.961 | 0.990 | 0.962 | 1.044 | 0.977 | 0.997 | 0.991 | 2.916 |
10.000 | 10.406 | 10.273 | 9.957 | 10.309 | 10.331 | 9.878 | 9.985 | 10.163 | 2.110 |
C(μg/mL) | Mean±SD(μg/mL) | RSD(%) |
0.10 | 0.104±0.004 | 3.96 |
1.00 | 1.045±0.046 | 4.36 |
10.00 | 10.164±0.221 | 2.18 |
考虑到USP、UCP经口服吸收进入循环系统时可能会有部分前药被破环，使得血液循环中药物可能以游离PTX和前药两种形式存在，故我们测定了游离PTX及总PTX的量，以更准确的评定两种纳米制剂的药代动力学行为。各组药动学参数见表4.7所示，药时曲线如图4.3所示。结果显示USP、UCP纳米制剂具有相似的药动学行为，相比于Taxol口服组，其半衰期由11.68 h分别延长至20.46 h和18.08 h，Cmax值分别提高了5.67倍和5.42倍，且生物利用度分别提高了6.90倍和5.27倍。与Taxol注射组相比，口服Taxol、USP和UCP的生物利用度分别为2.83%、19.50%和14.89%。这些结果表示USP、UCP纳米制剂能改善PTX的口服生物利用度并延长药物循环时间。除此之外，USP、UCP纳米制剂口服给药后血浆中游离PTX和总体PTX的药时曲线表明，药物在循环系统中多以前药形式存在，可以减少因药物过早泄露而引发的不良反应。
表4.7 药代动力学参数（n=5）
Parameters | Taxol(i.v.) | Taxol(p.o.) | UCP(free PTX) | USP(free PTX) | UCP(total PTX) | USP(total PTX) |
AUC0-t(mg/L*h) | 35.74±11.01 | 1.01±0.12 | 0.93±0.11 | 1.91±0.64 | 5.32±0.76*** | 6.97±0.93*** |
AUC0-∞(mg/L*h) | 36.26±10.99 | 1.08±0.15 | 1.03±0.24 | 2.34±0.99 | 6.15±1.34 | 8.38±2.24 |
t1/2(h) | 8.76±2.45 | 11.68±3.23 | 13.87±6.82 | 14.26±5.53 | 18.08±10.38 | |
Tmax(h) | 0.08±0.00 | 1.60±0.55 | 1.10±0.55 | 3.00±2.00 | 1.80±0.45 | 3.20±1.10 |
Cmax(mg/L) | 15.67±1.31 | 0.12±0.01 | 0.13±0.02 | 0.17±0.01 | 0.65±0.03 | 0.68±0.05 |
Frel(%) | — | 100.00 | 91.69 | 188.80 | 526.76 | 689.57 |
Fab(%) | 100.00 | 2.83 | 2.59 | 5.34 | 14.89 | 19.50 |
注：P<0.05标记为*，P<0.01标记为**，P<0.001标记为***。显著性差异分析结果显示，USP口服组和UCP口服组的AUC0~t与紫杉醇注射剂口服组的AUC0~t有极显著的差异，表明数据十分可靠。
图4.3 尾静脉注射Taxol组（a）与口服不同紫杉醇制剂组（b）的药-时曲线（n=5）
本次实验建立了PTX体内含量测定方法，且准确度试验结果显示低、中、高三种浓度的准确度在98.86%-101.74%之间，RSD值均小于3.19%，提取回收率的结果显示低、中、高三种浓度的提取回收率值均在92.66%-94.85%之间，RSD值均小于4.38%，专属性实验结果良好，验证了该方法专属性高、灵敏、稳定性好。之后以SD大鼠为实验对象，考察Taxol注射组、口服给药Taxol组、USP组和UCP组的药动学特征。结果显示，体内动物实验显示USP、UCP纳米制剂具有相似的药动学行为，相比于Taxol口服组，其半衰期由11.68 h分别延长至20.46 h和18.08 h，Cmax值由0.12mg/L分别提高到了0.68mg/L和0.65mg/L，且生物利用度分别由2.83%提高到了19.50%和14.89%。得出结论，前药纳米制剂USP、UCP口服的生物利用度和药代动力学参数对比传统紫杉醇注射剂均有所提高，具有纳米制剂在体内的优点，具备进一步研究的价值。
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